New Super Mario Bros. Wii stanowi niecodzienną mieszankę trybów kooperacji i rywalizacji pomiędzy graczami. Osoby dzierżące kontrolery nie tylko ze sobą walczą – zrzucając się ze skarp lub podkradając zebrane monety – ale również współpracują, co w wielu fragmentach poziomów jest nieodzowne. W innym wypadku gracze nie będą bowiem w stanie pokonać przygotowanych przez twórców przeszkód.

W grze wcielamy się w Mario, Luigiego, a także dwóch Toadów. W późniejszych etapach każdy może również dosiąść Yoshiego w kilku odmianach kolorystycznych.